Phosphoenolpyruvat:Glucose Phosphotransferase-System (PTS)

aus Escherichia coli

Das bakterielle Phosphotransferase-System ist für die spezifische Zuckeraufnahme in die Zellen zuständig, wobei die Zucker gegen einen Konzentrationsgradienten bei gleichzeitiger Phosphorylierung transportiert werden. Phosphatdonor ist das "energiereiche" Phosphoenolpyruvat (PEP). Über die löslichen Enzyme EI und HPr, die nicht zuckerspezifisch sind, wird das Phosphat auf einen Enzymkomplex EII übertragen. Dieser besteht aus den Komponenten A, B und C, wobei je nach Spezifität und Bakterium die Komponenten auch Domänen eines Proteins sein können. Komponente/Domäne C ist das eigentliche Transportprotein und in der Membran verankert. Im Glucose-PTS von E. coli ist EIIA ein lösliches Protein, EIIB/C ist membranständig.

Die vom PEP abgespaltene Phosphatgruppe wird in den Proteinen kovalent an Histidin oder Cystein gebunden. Der Phosphorylierungsgrad der Enzyme dirigiert auch Regelmechanismen in der Zelle (Katabolitrepression, Chemotaxis).

Enzym I

Enzym I wird durch PEP autokatalytisch phosphoryliert. Das 64 kD große Protein ließ sich bisher nicht kristallisieren, aber der aminoterminale Teil (inclusive des aktiven His) ist für eine Strukturanalyse zugänglich. In dem hier gezeigten Modell sind die Aminosäuren 2 - 249 sichtbar.

Enzym I Anfangsbild

Dieser Teil des Proteins besteht aus einer alpha-Subdomäne (Aminosäuren 30-142), sowie einer alpha/beta-Subdomäne (Aminosäuren 2-19 und 156-229). Hier bilden ein viersträngiges paralleles Faltblatt und ein dreisträngiges antiparalleles Faltblatt ein Sandwich, wobei die Stränge etwa um 90° gekreuzt sind . Ein Strang ist Teil beider Faltblätter . Eine helicale Region dient als Verbindung zur (hier nicht sichtbaren) carboxyterminalen Domäne.

Bei einem Vergleich der Aminosäuresequenzen von Enzym I aus verschiedenen Bakterien zeigt sich, daß eine Reihe von Aminosäuren vollständig oder konservativ in der Evolution erhalten sind. Das gilt besonders für die Umgebung des aktiven Histidin . Die Phosphorylierung erfolgt an einem Ring-Stickstoff , der in diesem Kristall eine Wasserstoffbrücke zu einem benachbarten Threonin bildet . Im phosphorylierten Zustand muß das Histidin deshalb eine andere Konformation annehmen, was sterisch möglich ist. Es liegt so in einer Furche zwischen den Subdomänen, daß der Ring beweglich ist .

HPr

Das histidinenthaltende Phosphorüberträgerprotein (HPr) ist ein Molekül von nur 85 Aminosäuren. Es besteht aus einem viersträngigen antiparallelen beta-Faltblatt , vor dem drei Helices liegen . Helices a und c sind amphipatisch , ihre hydrophilen Seiten (blau) zeigen nach außen, während die hydrophoben Aminosäuren (gelb) in das Innere des Proteins zeigen und so mit dem Faltblatt den hydrophoben Kern des Proteins bilden. Der Aminoterminus wird durch eine Ionenbindung zwischen Met1 und Glu70 (am Anfang von Helix c) in Position gehalten . Aufgrund der NMR-Spektren von HPr ergibt sich für das Hydroxyl-Proton von Ser31 eine besonders starke Bindung in Wasserstoffbrücken, dieses Proton tauscht nicht mit dem Wasser der Umgebung aus . Einige der Schlaufen zwischen den Helices und beta-Strängen werden durch Turns (blau) stabilisiert. Die bei der Phosphatübertragung aktive Aminosäure ist His15 . Infolge der Bindung des Phosphors an den Ring des Histidin-15 nimmt das Protein eine andere Konformation an. Bei der gemeinsamen Abbildung der Strukturen von HPr (weiß) und P-HPr (blau) werden die Verschiebungen im Faltungsmuster sichtbar. Für einige aus dem Protein herausragende Seitenketten gibt es große Unterschiede , auch His15 nimmt eine etwas andere Stellung ein .

Proteine sind keine starren Gebilde, besonders die Seitenketten von Aminosäuren können beträchtliche Beweglichkeit aufweisen. Wenn die Proteinstruktur (wie in diesem Fall) durch NMR-Untersuchungen an gelöstem Protein ermittelt wird, kann durch Simulation molekularer Dynamik die Beweglichkeit demonstriert werden. In dem unteren Bild ist der Bereich um das aktive Histidin (Aminosäuren 14-19) dargestellt (links HPr, rechts P-HPr).

Enzym II A

Enzym IIA ist in der Phosphorylierungskette des PTS das erste zuckerspezifische Enzym. Sein Phosphorylierungsgrad ist ein Sensor für den metabolischen Zustand der Zelle. Es überträgt nicht nur die Phosphatgruppe auf die Glucosepermease EIIB/C, sondern regelt auch die Chemotaxis gegenüber Zuckern, die über das PTS aufgenommen werden. Außerdem regelt es die Aktivität der Adenylatcyclase, einige Permeasen für nicht-PTS-Zucker und die Transcription einiger Operons. Das Enzym hat ein Molekulargewicht von 18,1 kD und besteht aus 169 Aminosäuren. Für die Aminosäuren 19 - 168 konnten aus Röntgenstrukturuntersuchungen die Atomkoordinaten ermittelt werden.

Die Anordnung der beta-Stränge im Faltungsschema deutet auf eine Symmetrie des Proteins. Es gibt auf Sequenzebene homologe Bereiche, hier lassen sich durch Drehung des Moleküls um ca. 180° 46 Paare von C_alpha-Atomen mit geringen Abweichungen zur Deckung bringen. Möglicherweise entstand dieses Protein durch eine Genduplikation.

Enzym II A Anfangsbild Sicht auf die Quasisymmetrieachse

Die Tertiärstruktur von EIIA wird durch die drei Faltblätter dominiert . Sie geben dem Protein die Form eines gedrückten Fasses . Es gibt nur wenige kurze helicale Abschnitte . Im Bereich von Asn32 bis Ile45 gibt es eine 3₁₀-Helix (a), die über einen gamma-Turn direkt mit einer regulären alpha-Helix (b) verbunden ist (Wasserstoffbrücken in grün).

EIIA enthält zwei Histidine (His75 und His90). His90 ist der Acceptor für die Phosphatgruppe von HPr, His75 ist für die Weitergabe an den Permease-Teil wichtig. Die beiden His liegen dicht nebeneinander in einer Furche zwischen den Helices a/b und c und dem Rand des mittleren Faltblattes . Sie sind von einem Ring hydrophober Aminosäuren (Phe41/71/88, Val39/40/46/96, Ile93) umgeben . Die Amid-Stickstoffatome von Asp94 und Thr95 zeigen in die Richtung des Phosphates, wenn es an His90 gebunden ist . Die in EIIA konservierten Asp38/94 sind wichtig für den Kontakt zu anderen Proteinen der Reaktionskette.

Enzym II B

Das E. coli-Enzym II B/C kommt in der Membran als Homodimer vor und besteht aus zwei Domänen. Die Domäne IIC kreuzt achtmal die Membran und enthält die Zuckerbindungsstelle. Die hydrophile IIB-Domäne überträgt die Phosphatgruppe von IIA auf den Zucker. Von den 477 Aminosäuren des Gesamtproteins konnte für den IIB-Teil (386-477) die Struktur ermittelt werden.

Enzym II B Anfangsbild

EIIB ist ein alpha/beta-Sandwich aus einem viersträngigen Faltblatt und auf einer Seite drei Helices . Helix 1 und die beta-Stränge 3 und 4 sind hydrophob (gelb), während Helices 2 und 3 sowie die Stränge 1 und 2 amphipatisch sind . Der hydrophobe Kern der Domäne ist der membranverankerten Domäne C zugewandt, die amphipatischen Anteile sorgen für die Zugänglichkeit im Cytoplasma gelöster Komponenten .

Die Transphosphorylierungsreaktion erfolgt durch ein Cystein , das von phylogenetisch konservierten Arg, Asp und Gln umgeben ist. Diese Gruppe von Aminosäuren ist vollständig von Hydrophoben Aminosäuren eingerahmt . Das etwas hervorstehende Cys kann mit dem vertieft liegenden P-His von EIIA reagieren, die komplementären Oberflächen der Proteine um die reaktiven Zentren erleichtern den Kontakt.