1.03. Zellteilung: Mitose, Sprossung von Hefezellen

Nach K. BACHMANN: Versuchsanleitung für das Praktikum "Biologie für Mediziner", Universität Heidelberg, Februar 1974

bitte mitbringen

Filzschreiber (die Tinte darf nicht wasserlöslich sein). Sie werden den Filzschreiber mehrmals während des Praktikums benutzen.
Pinzette
Rasierklinge
Zeichenpapier
Bleistift

Mikroskop
Reagenzgläser
Objektträger
Deckgläser
Pasteurpipetten
Filterpapier
Papierhandtücher
Fixierflüssigkeit (3 Teile Methanol, 1 Teil Eisessig)
Schiffsches Reagenz (verschlossen halten) = Fuchsinschweflige Säure
1 n HCl
salzsaures Wasser (18 Teile Wasser, 1 Teil 1 n HCl; sollte auch 1 Teil 15% iges Natritummetabisulfat enthalten, wegen Gestanks weggelassen)
45 %ige Essigsäure
ausgekeimte Zwiebelsamen (3 Tage vor Praktikumstermin auf feuchtem Filterpapier ausgelegt)
Hefe
100 ml Erlenmeyer
Glucose (2%ig) gelöst in 0,1 m Phosphatpuffer pH. 6.7.
Herstellung: 40 ml 0,1 m Na₂HPO₄ + 60 ml 0,1 m NaH₂PO₄

Wasserbäder, eingestellt auf 60°C
Reagenzglasständer
Brutschränke, eingestellt auf 37°C

VORSICHT

In diesem Experiment wird mit gefährlichen Chemikalien umgegangen: Methanol ist leichtentzündlich. Es ist giftig beim Einatmen und Verschlucken. Es darf nicht in die Hände von Kindern geglangen. Behälter dicht geschlossen halten. Von Zündquellen fernhalten - nicht rauchen. Berührung mit der Haut vermeiden. Essigsäure ist entzündlich. Sie verursacht schwere Verätzungen. Sie darf nicht in die Hände von Kindern geglangen. Dampf nicht einatmen. Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. 1 n Salzsäure reizt die Augen und die Haut. Sie darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser abwaschen.

Das heutige Experiment ist eines der einfachsten des ganzen Praktikums. Wenn es sauber durchgeführt wird, kann es aber mehrere grundlegende methodische und theoretische Erkenntnisse zum Verständnis der Teilung von Zelle und Zellkern beitragen. Arbeiten Sie sorgfältig und achten Sie darauf, das Experiment nicht nur mechanisch auszuführen, sondern die einzelnen Vorgänge zu verstehen.

Es gibt grundsätzlich zwei methodische Angriffsmöglichkeiten, Aussagen über die Chemie von biologischen System zu erhalten, die biochemische und die histochemische. Biochemie ist "Reagenzglaschemie": irgendwann im Laufe des Versuchs wird die zu untersuchende chemische Fraktion aus den Geweben extrahiert und mit organisch - chemischen Methoden untersucht. Die Schwierigkeit dabei ist, daß es oft nicht möglich ist, die genaue Lokalisierung der extrahierten Fraktion innerhalb des Gewebes oder der Zelle festzustellen, und oft genug spielt die Lage eines Moleküls in der Zelle eine grundlegend wichtige Rolle. Biochemiker verwenden daher viel Arbeit darauf, vor der Extraktion der verschiedenen Moleküle Zellfraktionen herzustellen, das heißt, die Zelle aufzubrechen und Kerne, Mitochondrien, Grundcytoplasma, Membranfraktionen u.s.w. sauber voneinander zu trennen und dann einzeln biochemisch zu untersuchen. Mit möglichst milden Methoden wirklich saubere Fraktionen der einzelnen Zellbestandteile zu erhalten, ist eine der schwierigsten Aufgaben der Biochemie. Sie werden an anderer Stelle mehr darüber lernen. Andererseits kann man die Gewebe auch intakt lassen und chemische Reaktionen an Gewebeschnitten ausführen, die man unter dem Mikroskop (oder dem Elektronenmikroskop) anschauen kann.

Das tut man in der Histochemie (wenn man Gewebe untersucht) oder Cytochemie (wenn man Einzelzellen anschaut). Die Lokalisierung der verschiedenen chemischen Fraktionen bereitet dann viel weniger Schwierigkeiten; aber die chemischen Reaktionen, mit denen man die geringen Mengen Moleküle, die in einer Einzelzelle vorliegen, darstellen kann, sind sehr beschränkt. Meist koppelt man an die untersuchte Fraktion einen Farbstoff mit sehr hohem Extinktionskoeffizienten, von dem auch kleine Mengen unter dem Mikroskop sichtbar sind.

Biochemische und histochemische Methoden ergänzen einander, und für viele Untersuchungen lohnt es sich, beide anzuwenden. Im heutigen Experiment werden wir die DNS des Zellkerns mit der Feulgenreaktion (FEULGEN und ROSENBERG, 1924) spezifisch darstellen.

Die Feulgenreaktion basiert auf der Reaktion von farblosem Schiffschen Reagenz mit Aldehydgruppen, die zu rotgefärbten Verbindungen führt. Schiffsches Reagenz reagiert mit allen Aldehydgruppen. Wenn Sie nicht sehr sauber arbeiten, werden Sie überrascht sein, wieviele Aldehydgruppen in Ihrer Umgebung vorkomen: Hände, Kleidung, Schreibpapier, Tischplatten, Leitungswasser und vieles mehr gibt erstaunlich schöne positive Reaktionen, die nur nach rauher Behandlung mit starker Salzsäure wieder rückgangig gemacht werden können.

Auch in der Zelle gibt es Aldehydgruppen in den verschiedensten Molekülen, z.B. in Zucker. Es gibt keine freien Aldehydgruppen in der DNS. Die Zuckermoleküle (Desoxyribose), die in die DNS - Struktur eingebaut sind, liegen in geschlossener Ringform vor, die am ersten C-Atom mit einer der vier Basen (Adenin, Thymin, Guanin oder Cytosin ) verbunden sind, deren Reihenfolge die DNS ihre biologische Spezifität verdankt. In den einander komplementären Strängen stehen sich die Basen A und T, sowie C und G gegenüber, sie sind einander komplementär, die Basenpaare werden durch zwei, bzw. drei Wasserstoffbrücken zusammengehalten. Bevor die Zelle mit Schiffschem Reagenz angefärbt wird, müssen also alle kleineren Moleküle mit Aldehydgruppen aus der Zelle entfernt werden und die Aldehydruppen der Zuckermoleküle in der DNS freigesetzt werden.

1. Fixierung: Es gibt verschiedene Substanzen, mit denen die Zelle vor der histochemischen Behandlung fixiert werden kann: Formalin, Alkohol, verschiedene Gemische. In allen Fällen werden die Eiweiße der Zelle denaturiert, verlieren dadurch ihre Funktion, werden innerhalb der Zelle zusammengeklebt und bleiben als ein Proteinskelett der Zelle fest liegen. Lipide werden meist vollständig extrahiert. Da die Zellmembran ihre Struktur Lipidmolekülen verdankt, bricht die Membranstruktur auf und chemische Reagenzien haben freien Zutritt zu den Makromolekülen im Zellinneren. Alle kleineren Moleküle werden aus der Zelle ausgewaschen. Nach der Fixierung liegt also ein Netzwerk aus denaturierten Proteinen vor, in dem auch die anderen Makromoleküle (Kohlenhydrate und Nukleinsäuren) festliegen.

2. Hydrolyse der DNS: Wenn die DNS milder Hydrolyse mit verdünnten Säuren unterworfen wird, brechen die Wasserstoffbrücken, die die beiden Ketten der Doppelhelix zusammenhalten. Die "Innenseite" des Moleküls wird also chemischen Reaktionen zugänglich. Durch die Hydrolyse werden dann die Purinbasen (Adenin und Guanin) spezifisch entfernt. Nachdem die Purinbase abhydrolysiert ist, kann die Aldehydgruppe am Kohlenstoffatom 1 des Zuckers mit Schiffschem Reagenz gefärbt werden. Jedes Basenpaar der DNS liefert also eine Aldehydgruppe für die folgende Reaktion. Unter genau kontrollierten Umständen ist die Reaktion so spezifisch, daß sie zur quantitativen Messung des DNS - Gehalts einzelner Zellen benutzt werden kann. Das ist besonders dann aufschlußreich, wenn innerhalb eines Gewebes die DNS - Mengen in verschiedenen Kernen variieren (Tumoren, pathologische Zustände verschiedener Gewebe, Gewebe mit hoher Zellteilungsrate und DNS - Synthese, normale Leber verschiedener Tierarten und des Menschen, besonders bei der Regeneration und unter dem Einfluß verschiedener Hormone). Für das heutige Experiment können wir schneller arbeiten, wenn wir auf quantitative Genauigkeit verzichten. Eine Hydrolyse in einnormaler Salzsäure (1 n HCl) für 10 Minuten extrahiert viele der Zellproteine, alle RNS und etwa 60% der DNS. Da aber in jedem Kern einige Millionen Basenpaare vorliegen, gibt die verbleibende DNS eine deutliche Feulgenreaktion.

3. Färbung: Vollständiges Anfärben der Aldehydgruppe der hydrolysierten DNS benötigt etwa eine Stunde. Bereits nach einer halben Stunde sind aber die meisten Aldehyde an Schiffsches Reagenz gebunden. Nach der Färbung sollte man alles nicht stöchiometrisch gebundene Reagenz in einer sauren Schwefeldioxydlösung auswaschen. Da Schwefeldioxyd einen unangenehmen Geruch hat, der leicht zur Evakuierung des Labors führen könnte, werden wir wieder auf quantitative Genauigkeit verzichten und in leicht salzsaurem Wasser nachwaschen. Die Zellen können dann in 45% Essigsäure erweicht und auf einem Objektträger ausgequetscht werden.

1. Schneiden Sie die ersten zwei bis drei Millimeter von ein paar Wurzelspitzen einer aufkeimenden Zwiebel ab. Legen Sie die abgeschnittenen Stücke in die Fixierflüssigkeit [3 Teile Methanol, 1 Teil Eisessig (Eisessig ist konzentrierte Essigsäure)]. Lassen Sie die Wurzelspitzen 30 Minuten lang in der Fixierflüssigkeit. Halten Sie das Fixierglas verschlossen.

2. Markieren Sie ein Reagenzglas mit der Nummer Ihres Arbeitsplatzes, füllen Sie das Glas mit einigen Millilitern 1 n HCl und stellen Sie das Glas ins Wasserbad, damit es auf die Temperatur von 60°C vorgewärmt wird.

3. Nach einer halben Stunde werden die Wurzelspitzen aus der Fixierungsflüssigkeit entnommen. Wenn Sie die Wurzelspitzen anfassen, dann nur am abgeschnittenen Ende. An der Spitze der Wurzel sitzt das Meristem, in dem durch Teilung neue Zellen entstehen. Dort finden Sie Zellen in Mitose, die Sie sich später anschauen wollen. Legen Sie die Wurzelspitzen zum Abtrocknen kurz auf ein Stück Papierhandtuch. Danach werden sie für 10 Minuten in die warme Salzsäure gebracht und im Wasserbad belassen.

4. Nach 10 Minuten Hydrolyse entnehmen Sie das Reagenzglas und füllen es mit kaltem Leitungswasser. Gießen Sie das Leitungswasser vorsichtig in den Ausguß, ohne die Wurzelspitzen zu verlieren. Wiederholen Sie das Waschen mehrmals, bis Sie sicher sind, daß alle Säure ausgewaschen ist. Dann werden die Wurzelspitzen auf ein Stück Filtrierpapier gelegt.

5. Erst jetzt öffnen Sie das Glas mit dem Schiffschen Reagenz kurz, um die Wurzelspitzen hineinzulegen. Das Glas wird gleich wieder fest verschlossen. Nach einer halben Stunde sollten die Wurzelspitzen tiefrot ausgehen. Nun nehmen Sie die Wurzeln aus der Lösung. VORSICHT : Schiffsches Reagenz färbt: Hände, Kleidung, Möbel . . . . . .Waschen Sie die gefärbten Wurzeln mehrmals in saurem Wasser.

6. Jetzt kommt der Arbeitsgang, der den Unterschied zwischen einem guten Präparat und einem zerbrochenen Objektträger mit einem Stück Dreck darauf ausmacht: Legen Sie die angefärbte Wurzelspitze auf einen Objektträger. Geben Sie ein paar Tropfen 45% ige Essigsäure darauf, um das Gewebe zu erweichen, legen Sie ein Deckglas darüber und zerquetschen Sie das Gewebe zwischen Objektträger und Deckglas. Nehmen Sie eine einzelne Wurzelspitze dazu. Um eine saubere Lage einzelner Zellen zu erhalten, geht man am Besten so vor: Zuerst wird mit dem stumpfen Ende eines Bleistiftes oder dem Ende einer Pinzette ganz vorsichtig auf das Deckglas geklopft (Deckgläser sind äußerst zerbrechlich). Dabei sollte die Wurzel bereits auseinanderfallen und sich unter dem Deckglas ausbreiten. Dann wird der Objektträger auf eine weiche Unterlage (flach gefaltetes Papierhandtuch) gelegt und das Deckglas mit einem Stückchen Papierhandtuch bedeckt. Nun drücken Sie, erst vorsichtig, dann so hart Sie können mit dem Daumen auf das Deckglas. Der Druck muß genau von oben erfolgen. Wenn das Deckglas auf dem Objektträger herumrutscht, rollt sich die Wurzelspitze in eine nutzlose kleine Wurst auf, bevor das Deckglas zerbricht. Sie wollen die Wurzelspitze unter dem unzerbrochenen Deckglas schön breit in eine Lage Einzelzellen zerdrücken. Bitte mit Gefühl arbeiten.

7. Wischen Sie die Unterseite des Objektträgers trocken bevor Sie das Präparat auf den Tisch des Mikroskops legen. Lassen Sie das Präparat nicht austrocknen. Gelegentlich können Sie einen Tropfen Wasser unter das Deckglas bringen.

1. Spezifität der Feulgenfärbung. Sind nur Kerne angefärbt und sonst nichts? In pflanzlichem Material färben sich bisweilen andere Strukturen leicht an. Welche, warum ?

2. An der Wurzelspitze befindet sich ein embryonales Gewebe, das Meristem der Wurzel. Hier entstehen durch Teilung alle Zellen der Wurzel. Einige davon werden zur Spitze hin abgegeben und bilden eine Wurzelhaube, die die auswachsende Wurzel gegen die Reibung in der Erde schützt. Die Zellen der Wurzelhaube sterben bald ab, werden schleimig und werden durch die Wachstumsbewegung der Wurzel im Boden abgeschürft. Andere Zellen aus dem Meristem werden nach hinten abgegeben und bilden laufend das Vorderende der wachsenden Wurzel. Durch weitere Zellteilung im Meristem gelangen diese Zellen immer weiter weg vom Vorderende der Wurzel. Sie beginnen bald, sich in die verschiedenen Zelltypen der Wurzelgewebe zu differenzieren. An einem unzerquetschten Präparat unter der geringsten Vergrößerung des Mikroskops können Sie die verschiedenen Regionen der Wurzelspitze auffinden. Nun suchen Sie nach Zellen aus den verschiedenen Gebieten in Ihrem Quetschpräparat.

3. Zellen des Meristems sind mehr oder weniger quadratisch. Da im Meristem Zellteilungen vorkommen, sollten Sie mit einigem Glück alle Stadien der Mitose finden. Wenn Sie wirklich gut gequetscht haben, können Sie Metaphasen finden, die so flach ausgedrückt sind, daß Sie Chromosomen zählen können. Wieviel Chromosoomen hat die Zwiebel? Identifizieren Sie die verschiedenen Mitosestadien.

4. Interphasekerne und Nukleolen. Die meisten Kerne in Ihrer Präparation sind Interphasekerne, in denen die Chromosomen nicht einzeln erkennbar sind, sondern ein Chromatingerüst bilden. In diesem Chromatingerüst erkennen Sie ganz deutlich eine Struktur, die nach Feulgenfärbung als großes leeres Loch im Kern erscheint. Das ist der Nukleolus. Der Nukleolus spielt eine wichtige Rolle bei der Synthese von ribosomaler RNS. Hätten wir den Kern mit einem basischen Farbstoff angefärbt (Hämatoxylin wird oft dazu benutzt), der mit den Phosphatgruppen von DNS und RNS reagiert, dann wäre der Nukleolus der am stärksten gefärbte Teil des Kerns. Da wir aber die RNS in der Hydrolyseperiode entfernt haben, ist wenig vom Inhalt des Nukleolus übrig geblieben. Beachten Sie aber, daß um die Oberfläche des Nukleolus ganz besonders viel DNS angelagert ist. Eine besondere DNS- Fraktion mehrerer (oder aller) Chromosomen trägt zu diesem "perinudeolären Chromatin" bei.

5. Differenzierung. Nach der Teilung werden die Zellen der Wurzel aus dem vorwärts fortschreitenden Meristem nach hinten verdrängt und beginnen sich in die verschiedenen Zelltypen des Wurzelgewebes zu differenzieren. Dabei strecken sich die meisten Zellen. Durch die Streckung der Zelle wird auch der Kern verformt. Kerne differenzierter Zellen sind länglich und weisen Nukleolen auf (die ribosomale RNS der Nukleolen wird natürlich benötigt, wenn Proteinsynthese stattfinden soll. Eine Zelle mit einem großen Nukleolus und viel RNS im Zytoplasma ist eine synthetisch aktive Zelle).

6. Polyploidie. Eine typische Eigenschaft differenzierter Pflanzenzellen ist das Auftreten polyploider Kerne. Die DNS der Kerne verdoppelt sich, ohne daß es zur Zellteilung kommt. Das ist eine Methode, die Anzahl der Gene pro Zelle zu verdoppeln. In Pflanzenzellen ist das möglich, weil sich diese Zellen nicht mehr teilen müssen. Alle Teilungen finden im Meristem statt. Bei Tieren ist der Wachstumsvorgang etwas komplizierter und polyploide Zellen entstehen daher nur in ganz besonderen Fällen. Polyploide Interphasekerne scheinen nur in seltenen Fällen durch eine Mitose wieder zu diploiden reduziert werden zu können und auch eine Mitose des polyploiden Kerns in zwei polyploide macht einige Schwierigkeiten. In Ihren Präparaten erkennen Sie polyploide Kerne an ihrer besonderen Größe und daran, daß sie zwei anstatt einem Nukleolus aufweisen (Tetraploidie). Normalerweise bildet ein diploider Kern bei der Zwiebel nur einen Nukleolus, obwohl er natürlich zwei Chromosomensätze enthält.

Hefe der Art Saccharomyces cerevisiae vermehrt sich durch Sprossung. Dieser Vorgang ist ohne viel Aufwand leicht zu induzieren und zu beobachten. Nehmen Sie ein kleines Stück Bäckerhefe und suspendieren Sie es in ca. 30 - 40 ml Glucoselösung. Wir haben als Lösungsmittel der Glucose einen schwach sauren Puffer gewählt, weil Pilze in dem Bereich besser wachsen als im alkalischen. Die Glucose dient uns als Energiequelle.

Betrachten Sie die Hefezellen unter dem Mikroskop unmittelbar nach dem Ansetzen der Suspension. Achten Sie vor allem darauf, ob Sie sprossende Zellen finden. Geben Sie zu Ihrer Hefesuspension einen Tropfen Jod - Jodkaliumlösung. Wie verfärbt sie sich? Inkubieren Sie die Hefesuspension für ca. 3 Stunden bei 37°C im Brutschrank. (Beschriften Sie Ihre Probe, um Verwechslungen vorzubeugen.)

Wie sehen die Zellen nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden aus? ( Skizze anfertigen )
Wie sehen sie nach Jod - Jodkalium - Zugabe aus?

Schätzen Sie ab, bei wieviel Prozent der Zellen Sie eine Sprossung sehen.