Elektronenmikroskopie

1924 erkannte der Belgier L. de BROGLIE den Wellencharakter der Elektronenstrahlen und schuf damit die Voraussetzung zur Konstruktion eines Elektronenmikroskops. Den Prototyp bauten M. KNOLL und E. RUSKA (Technische Universität Berlin, 1932). Eines der ersten elektronenmikroskopischen Bilder eines biologischen Objekts war die Darstellung des Tabakmosaikvirus (TMV); das erste elektronenmikroskopische Bild einer Zelle wurde 1945 von K. R. PORTER, A. CLAUDE und E. F. FULLAM (Rockefeller Institute, New York) veröffentlicht

Aufbau und Strahlengang; TEM

Vorab sei vermerkt, daß man heutzutage die konventionellen Elektronenmikroskope TEM (Transmissionselektronenmikroskope) nennt. Wir werden uns daher zunächst mit ihrem Aufbau befassen. Der Elektronenstrahl wird durch eine stromdurchflossene und dadurch aufgeheizte, haarnadelförmig gebaute Kathode erzeugt und durch eine an eine Anode angelegte Hochspannung abgesaugt. Diese Beschleunigungsspannung beträgt größenordnungsmäßig 50-150 kV. Je höher sie ist, desto geringer ist die Wellenlänge der Elektronenstrahlung und desto höher das Auflösungsvermögen. Allerdings wird die Auflösung in der Elektronenmikroskopie weniger durch diesen Faktor als vielmehr durch die Qualität der Linsensysteme, vor allem aber durch die Herstellungstechnik des Präparats begrenzt. Moderne Geräte erreichen Auflösungen von 0,2-0,3 nm bei biologischen Objekten sind aber nur selten Auflösungen unter 2 (1) nm zu erreichen. Die förderliche Vergrößerung liegt damit in der Großenordnung von 300 000.

Der beschleunigte Elektronenstrahl tritt durch eine Bohrung am Boden der Anode hindurch, und sein Weg kann nunmehr analog dem eines Lichtstrahls im Lichtmikroskop verfolgt werden. Die Linsensysteme bestehen aus stromdurchflossenen Spulen, die um sich herum ein elektromagnetisches Feld erzeugen. Der Strahl wird als erstes durch einen Kondensor gebündelt. Er tritt dann durch das Objekt hindurch, an dem er partiell abgelenkt wird. Der Grad der Ablenkung hängt von der Elektronendichte der Atome im Präparat ab. Je höher deren Atommasse ist, desto stärker ist die Ablenkung. Da biologische Objekte zum überwiegenden Teil aus Atomen niedriger Ordnungszahlen (C, H, N, O) bestehen, erzeugen sie einen nur geringen Kontrast. Die Präparate müssen daher in der Regel durch spezielle Kontrastmittel (Schwermetalle) behandelt werden, damit man überhaupt etwas erkennt. Sie dürfen zudem nicht viel dicker als 100 nm sein, denn durch Elektronenabsorption wird die Temperatur erhöht. Die wiederum kann zur Zerstörung des Objekts führen. Im Elektronenmikroskop können grundsätzlich keine lebenden Objekte beobachtet werden.

Nach Durchtritt durch das Objekt werden die gestreuten Elektronen von einem Objektiv gesammelt; es entsteht dadurch ein Zwischenbild, das anschließend durch ein weiteres Linsensystem (hier Projektiv genannt) nachvergrößert wird. Das dabei entstehende Bild wird auf einem fluoreszierenden Schirm sichtbar gemacht oder auf photographischem Film dokumentiert. Elektronenmikroskopische Bilder sind stets schwarz-weiß. Der Schwärzungsgrad (Grauschattierungen) spiegelt die Elektronendichte (= Atommassenunterschiede) im durchstrahlten Praparat wider.

Rasterelektronenmikroskop (REM)

Anders als bei dem gerade beschriebenen Transmissionselektronenmikroskop verläuft der Strahlengang im Rasterelektronenmikroskop (REM, im Englischen: scanning electron microscope; SEM). Die verwendete Technologie basiert auf Erkenntnissen der Fernsehtechnik. Das Verfahren eignet sich zur Darstellung leitender Oberflächen; biologische Objekte müssen daher zunächst durch Aufdampfen eines Metallfilms (meist Gold) leitend gemacht werden. Das Auflösungsvermögen ist üblicherweise geringer als beim TEM, die Tiefenschärfe jedoch um Größenordnungen höher. Die Rasterelektronenmikroskopie eignet sich deshalb auch zur Darstellung von Objekten bei ausgesprochen schwachen Vergrößerungen (Lupenvergrößerungen). Zahlreiche Beispiele hierfür finden sich in anderen Themen.

Die Objektoberfläche wird durch den primären Elektronenstrahl Punkt für Punkt abgetastet, wodurch sogenannte Sekundärelektronen freigesetzt werden. Die Intensität der Sekundärstrahlung ist vom Neigungswinkel der Objektoberfläche abhängig. Die Sekundärelektronen werden von einem seitlich schräg über der Probe angebrachten Detektor aufgefangen. Das Signal wird elektronisch verstärkt. Die Vergrößerung ist kann stufenlos wählbar sein (je nach Gerätetyp), und das Bild erscheint zeitsequenziell auf einem Kathoden- bzw. Fernsehbildschirm.

Abschließend einige Bemerkungen über Neu-, bzw. Weiterentwicklungen.

1. Das Hochspannungselektronenmikroskop (high voltage electron microscope): Es arbeitet mit einer Beschleunigungsspannung von 700-3000 kV. Sein Auflösungsvermögen ist höher, die Objekte können dicker sein, ihre Belastung ist geringer. Nachteilig ist jedoch der immense apparative Aufwand. Es gibt auf der ganzen Welt nur einige wenige Geräte. Neue Erkenntnisse für die Botanik liegen noch nicht vor.

2. Das Scanning-Transmission-Electron-Microscope (STEM): Bei dieser Fortentwicklung des REM (SEM) wird das Präparat durchstrahlt, und die bei der Durchstrahlung erzeugte Sekundärstrahlung wird genutzt. Auch hier ist der Aufwand groß, er lohnt sich aber, weil hierdurch große Moleküle (Nukleinsäuren, Proteine) oder Molekülkomplexe (z.B. Viren) besser und schonender dargestellt werden können als im TEM. Für die botanische Forschung gibt es z.Zt.. aber auch hier noch nichts Neues.

Die Auswertung elektronenmikroskopischer Bilder geschieht in zunehmendem Maße durch computergesteuerte Auswertungsprogramme. Allerdings eignen sie sich meist nur für die Rekonstruktion regelmäßig wiederkehrender Muster; diese wiederum sind auf molekularer Ebene eher gegeben als auf zellulärer.