Mikrophotographie; Bildverarbeitung durch Videokameras, AVEC-DIC, AVEC-POL

Hintergrundsubtraktion

Parallel zur Entwicklung der Mikroskopie entstand Bedarf, das Gesehene zu dokumentieren. Das klassische und von allen Biologiestudenten geübte Verfahren ist das Zeichnen. Eine Erleichterung brachte die Konstruktion eines Zeichengeräts durch E. ABBÉ, das dem Okular aufgesetzt wird und bei dem das Bild über ein Prisma und einen Spiegel auf eine Zeichenunterlage projiziert wird. Als eine Alternative bot sich später die Mikrophotographie an, durch die jedoch wegen der geringen Tiefenschärfe des Bildes jeweils nur einzelne Ebenen des Präparats erfaßt werden können. Gerade deshalb wird sie auch heute noch von einigen Biologen recht kritisch gesehen. Sie hat sich trotzdem als eine unabhängige Methode durchgesetzt. Wenn es sein muß , können mehrere Bilder von unterschiedlichen Ebenen des Präparats angefertigt werden. Die wichtigsten Vorteile gegenüber der Zeichnung sind einmal die Geschwindigkeit, mit der die Dokumentation erfolgt, zum anderen der Ausschluß subjektiver Bewertungen (künstlerische Freiheit des Zeichners), durch die einer Darstellung mehr Schaden als Nutzen zugefügt werden kann. Der parallele Einsatz verschiedener mikroskopischer Verfahren am gleichen Präparat urlaubt es, dasselbe Objekt mit unterschiedlichen Methoden zu studieren und entsprechende Aufnahmen nebeneinanderzustellen, um so die Orientierung zu gewährleisten. Das heute erhältliche Filmmaterial erlaubt es, auch bei denkbar ungünstigen Lichtverhältnissen (z.B. bei der Fluoreszenzmikroskopie) zu befriedigenden Ergebnissen zu gelangen.

Die Möglichkeiten der Kinematographie wurden schon kurz gestreift. Es gibt eine Menge an Dokumentarfilmen über Bewegungsabläufe in Zellen, von Zellen, von Paarungsreaktionen u.a. Die Mehrzahl der in Deutschland gedrehten Filme entstand (und entsteht) in Zusammenarbeit mit dem Institut für den Wissenschaftlichen Film in Göttingen (Universitäten und andere wissenschaftliche Einrichtungen können die Filme dort kostenlos entleihen).

Videokameras, Restlichtverstärker und computergesteuerte Bildspeicherung und -auswertung sind aus der modernen Mikroskopie ebenfalls nicht mehr wegzudenken. Erste Anwendungen hiervon gab es bereits zu Beginn der fünfziger Jahre, die wichtigsten Entwicklungen setzten jedoch erst Ende der siebziger ein.

Zu nennen sind zwei von R. D. ALLEN (Dartmouth College, Hanover, New Hampshire, USA) entwickelte Verfahren:

AVEC-DIC (Allen video-enhanced contrast - differential interference contrast)

und

AVEC-POL (Allen video-enhanced contrast - polarization microscopy).

Beide Verfahren beruhen auf der Erkenntnis, daß bestimmte Videokameras (die richtige Auswahl des Modells ist allesentscheidend) Helligkeitsunterschiede um Größenordnungen besser verarbeiten als das menschliche Auge oder ein photographischer Film. Je nach Fragestellung oder Objekt können die Kennlinien der Kamera verschieden eingestellt werden. E. ABBÉ definierte, wie besprochen, das Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops als denjenigen Abstand zwischen zwei Punkten, in dem sie noch als gerade getrennte Einheiten wahrgenommen werden können. Der limitierende Faktor ist die Lichtwellenlänge. Diese Auflösungsgrenze besagt aber nicht, daß kleinere Strukturen unsichtbar bleiben. So lassen sich z.B. durch Fluorochromierung einzelne Molekülkomplexe sichtbar machen, vorausgesetzt, die Abstände zwischen gleichartigen Molekülen (Molekülkomplexen) liegen über der mikroskopischen Auflösungsgrenze.

An die Stelle der Fluorochromierung kann eine Kontrastverstärkung durch AVEC-DIC treten, und obwohl der Kontrast, den z.B. Mikrotubuli hinterlassen, nicht ausreicht, um vom menschlichen Auge wahrgenommen zu werden, kann er von der Kamera erfaßt und identifiziert werden.

Durch Bildspeicherung und -auswertung können u.a. gezielt bewegliche Teilchen hervorgehoben werden. Das einschlägige Computerprogramm subtrahiert den Bildinhalt eines Bildes von dem, welches Sekunden oder Minuten vorher an der gleichen Stelle aufgenommen wurde. Alle unbeweglichen Strukturen verschwinden, und nur die beweglichen werden abgebildet.

Kameras mit Restlichtverstärker werden in der Fluoreszenzmikroskopie zum Nachweis von Fluorochromen eingesetzt, deren Fluoreszenz weit unterhalb der Empfindlichkeitsschwelle des menschlichen Auges liegt. Das schon erwähnte Verfahren der Vitalfärbung kann wieder aufgegriffen werden, da heute weit mehr und wesentlich spezifischere Sonden zur Verfügung stehen als in den vierziger und fünfziger Jahren. Wegen der noch geringeren Konzentrationen werden die Zellen noch weniger geschädigt.

Während bei der nunmehr schon gängigen Fluoreszenzmikroskopie nach Bestrahlung des Objekts Photonen emittiert und registriert werden (Fluoreszenz), lassen sich mit einem Photoelektronenmikroskop Sekundärelektronen nachweisen, die nach Bestrahlung (mit UV-Strahlung) aus einem Präparat freigesetzt werden. Das Gerät verfügt über eine Elektronenoptik (siehe folgenden Abschnitt), die Auflösung ist höher als bei der Fluoreszenzmikroskopie. Die Technik wurde erst vor kurzem entwickelt, erste Ergebnisse an biologischen Objekten liegen vor; sie lassen erwarten, daß das Verfahren in absehbarer Zeit mit einer weiteren Verbreitung rechnen kann (O. H. GRIFFITH, G. B. BIRRELL, 1985.).