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Die Fluoreszenzmikroskopie beruht auf der Tatsache, daß gewisse Moleküle einen Teil des von ihnen absorbierten Lichts in Form einer langwelligeren (energieärmeren) Strahlung wieder abgeben. Ein bekanntes Beispiel dafür ist die rote Eigenfluoreszenz des Chlorophylls. Seit den Untersuchungen des österreichischen Lehrers M. HAITINGER in den dreißiger Jahren weiß man, daß es eine Anzahl sogenannter Fluorochrome gibt, mit denen mikroskopische Präparate fluorochromiert werden können und die dadurch zu einem indirekten (oder sekundären) Fluoreszieren gebracht werden können. In den nachfolgenden Jahrzehnten wurde eine Anzahl sogenannter Vitalfarbstoffe gefunden oder entwickelt, die - in geringen Konzentrationen angewandt - bestimmte Teile der Zelle markieren, ohne sie zum Absterben zu bringen. Dadurch wurde es möglich, einen Stofftransport in Zellen und Geweben zu verfolgen oder den pH-Wert bestimmter Kompartimente, z.B. der Vakuole, zu ermitteln.
Seit etwa zwanzig Jahren erlebt die Fluoreszenzmikroskopie eine erneute Blüte, einmal, weil das Spektrum neuer, zum Teil hochspezifischer Fluorochrome erweitert werden konnte und zum anderen, weil völlig neue Ansätze, beispielsweise die indirekte Immunfluoreszenz, erfolgreich angewandt werden konnten. Hinzu kommen Verbesserungen im Mikroskopbau, sowie vor allem die Entwicklung leistungsfähiger Filter.
Ein Fluoreszenzmikroskop kann in zwei Ausführungen konstruiert werden: als Durchlicht- und als Auflichtfluoreszenzmikroskop. Ersteres ist die ältere Bauweise. Man benötigt drei Komponenten:
eine starke Lichtquelle, die vornehmlich kurzwellige Strahlung emittiert. Quecksilber-Hochdrucklampen haben sich hier bewährt.
Erregerfilter: Dieses Filter sorgt dafür, daß nur anregende Strahlung das Präparat erreicht. Es wird daher unterhalb des Präparats in den Lichtweg eingebracht. Darüber hinaus ist es vorteilhaft mit einem Dunkelfeldkondensor zu arbeiten.
Sperrfilter: Dieses Filter wird in den Strahlengang zwischen Objektiv und Okular eingeschoben. Es soll nur für langwellige, durch Emission am Präparat erzeugte "Sekundärstrahlung" (Fluoreszenz) durchlässig sein.
In den letzten Jahren hat die Auflichtfluoreszenzmikroskopie die Durchlichtfluoreszenzmikroskopie weitgehend abgelöst. Die Durchlichtfluoreszenz bleibt jedoch bei schwach vergrößernden Objektiven (2,5x, 6,3x) der Auflichtfluoreszenz überlegen. Bei dieser wirkt das Objektiv zugleich auch als Kondensor, und je stärker es ist, desto intensivere Strahlung steht zur Verfügung. Das Kernstück der Auflichtmikroskopie ist eine Konstruktion im Strahlengang zwischen Objektiv und Okular, über die die anregende Strahlung zugeführt wird, und die aus Erregerfilter, Teilerspiegel und Sperrfilter besteht.
Strahlengang in einem Epifluoreszenzmikroskop.
1. anregende Strahlung, 2. emittierte Strahlung (Fluoreszenz). Die angegebenen Nanometerwerte beziehen sich auf einen der möglichen Fälle. Durch wahl anderer Filtersysteme kann auch Licht anderer Wellenlängen verwendet werden (Nach Werkphoto CARL ZEISS).